ABC - Preparaty mikroskopowe
: czwartek, 5 kwietnia 2007, 16:36
Preparaty mikroskopowe
Robię czasami do stu preparatów dziennie, przeważnie typowo "kopulatorowe" na kawałku plastiku podpiętym pod okaz, rzadziej preparaty na szkiełkach. Balsam, balsam i jeszcze raz balsam! Odwodnienie - banalna rzecz - na szkiełku podstawowym mam przyklejone małe, plastikowe (polietylenowe) odcięte kapsle od PCR-ówek (takie małe, plastikowe probówki do PCRu, jakby ktoś nie wiedział to niech sobie w sieci poszuka), przyklejone oczywiście odwrotnie, co daje małe i wygodne zbiorniki na izopropanol i ksylen. Preparuję w kropli wody, obiekt przenoszę na jakąś minutę do izopropanolu, potem na równie krótko do ksylenu i jeśli nie jest zapowietrzony od razu do balsamu. Na drugi dzień sprawdzam położenie, jeśli trzeba nakładam kropelkę ksylenu (łebkiem od szpilki) i poprawiam obiekt; czasem trzeba tak kilka razy. Jeśli obiekt jest zapowietrzony to na zdjęciu mojego warsztatu w innym wątku widać kawałek styropianu z baterią kilku rzędów PCR-ówek - są one ponumerowane i zawierają ksylen albo izopropanol (czasem odpowietrzam w izopropanolu i potem przenoszę do ksylenu, czasem jest konieczność odklejenia czegoś i po to sam ksylen). Wkładam preparat do odpowiedniej probówki, pod okaz na szpilkę wędruje numer, żeby się nie pogubić (często odpowietrzam kilkadziesiąt kopulatorów). Przeglądam na drugi dzień, zwykle już jest odpowietrzone, rzadko trzeba trzymać dłużej.
Jeśli ma to być preparat na szkiełku mikroskopowym, to zasada jest ta sama, tylko trzeba pamiętać, że medium (niezależnie, co to będzie, może za wyjątkiem glicerożelatyny, ale to do trwałych się nie nadaje) wysychając przyciągnie szkiełko nakrywkowe do podstawowego i może zmiażdżyć preparat. Ja zawsze używam dwóch wąskich pasków plastiku (zwykle polipropylen) jako przekładek wzdłuż boków szkiełka nakrywkowego.
I parę słów o mediach - balsam kanadyjski ma długą tradycję stosowania i jest pewne, że przynajmniej przez sto lat nic złego się z preparatem nie stanie. Małe minusy są dwa - preparaty na plastiku trzymane przez lata w atmosferze p-dwuchlorobenzenu (jeśli ktoś tego używa) ciemnieją, stają się ciemnożółte (ale nie zmienia to przejrzystości, wszystko dobrze widać); i balsam jest sztywny i kruchy, chwila nieostrożności, wygięcie plastiku i kropla z preparatem może odpaść (rzadko, ale jednak ze dwa-trzy razy tak mi się stało, raz nawet w przypadku holotypu Schaufussa, co ja się naszukałem tego cholerstwa...).
Euparal - krótsze stosowanie, ale też najstarsze preparaty są w dobrej kondycji. Problemy - są różnej jakości preparaty euparalu, minimalnie różniące się właściwościami. To jest jakiś patent, ale jednak to, co np. kupowałem w Japonii różni się nieco od euparalu niemieckiego, z którym wcześniej miałem do czynienia. Euparal ma tendencję do pękania w czasie schnięcia, widziałem takie preparaty (w tym typy), w których pęknięcie przebiegało dokładnie przez kopulator... Mniejsza lepkość niż balsamu - trudniej wypozycjonować obiekt wymagający precyzyjnego położenia - ważne przy np. takich kopulatorach jak u Pselaphinae czy Scydmaenidae, gdzie przekręcenie na bok o parę stopni bywało w przeszłości podstawą do opisywania nowych rodzajów. Dużo łatwiej pozycjonować takiego fiuta w balsamie. Euparal natomiast świetnie się nadaje do kopulatorów (czy innych obiektów) płaskich, które same się rozkładają; np. jak muszę narysować skrzydło to tylko z euparalu (skrzydła takich maluchów to w ogóle osobna historia...). Wszystkie inne media radzę jednak traktować jako przejściowe, ostatecznie lepiej przełożyć do balsamu; szczególnie dotyczy to mediów opartych na wodzianie chloralu, które po wielu latach tak przyciemniają preparat, że staje się on bezużyteczny. Gliceryna (czysta, 100%) w zamkniętych szczelnie fiolkach jest OK. Problem jest z tą szczelnością - gliceryna jest silnie higroskopijna, ciągnie wodę z powietrza. To oznacza, że jeśli fiolka nie będzie idealnie szczelna to gdzieś na brzegach korka pojawi się rozcieńczony (właśnie wodą z powietrza) roztwór, który razem z drobinami kurzu jest świetną pożywką dla grzybów (takie np. Penicillium glaucum potrafi wyrosnąć w słoiku z miodem, to taki skrajny przykład organizmu, dla którego granica ciśnienia osmotycznego nadającego się jeszcze do życia jest bardzo przesunięta w stronę nieakceptowalną przez większość grzybów). I prędzej czy później grzyb weźmie się za nasz cenny preparat. Nie nastąpi to w ciągu roku czy dwóch, ale pod holotypem fiolki z gliceryną bym nie podpiął; tylko balsam.
To tak w wielkim skrócie z własnego doświadczenia (zrobiłem ładnych parę tysięcy preparatów) i literatury (kiedyś próbowałem sam się dowiedzieć co nieco na temat trwałości mediów, dotarłem nawet do informacji o muzeach, które przeznaczyły kupę forsy na przełożenie wielkich zbiorów z medium Hoyera do balsamu!!!).
Paweł Jaloszyński
--------------------------------------------------------------------------------------
Co do jednego Paweł ma na pewno rację, materiał typowy powinien być dobrze zabezpieczony i tu pewnie trzeba myśleć o balsamie.
Jednak do celów roboczych, oznaczania, dla zachowania struktury przestrzennej lub miękkich części kopulatora oraz jeżeli potrzebujemy obracać i oglądać preparat z różnych stron gliceryna jest dobrym wyjściem. Ja właśnie używam PCR'ów 0.2, gliceryna jest w nich utrzymywana w końcu pojemnika, jest dosyć mały, dobrze podpina się na szpilkę. Przez pewien czas dostawałem zużyte PCRy, cena przy zakupie niestety jest sporo większa niż zwykłych większych eppendorfów.
W niektórych sklepach (USA, Europa) są dostępne MicroVials o takim właśnie zastosowaniu, niestety cena też jest spora. Słyszałem, że niektórzy stosują różnego rodzaju rurki o małym przekroju, zasklepiane termicznie z jednej strony, ale tego ze względu na uwagi podane przez Pawła raczej nie należy polecać. Ale to dotyczy wszystkich otwartych pojemników.
Kiedyś odbyła się na jednym z wątków dyskusja o potencjalnej szkodliwości chemii. Swego czasu krążyły informacje o rakotwórczości ksylenu. Był to jeden z powodów, dla których drastycznie zmniejszyłem używanie balsamu.
-------------------------------------------------------------------------------------
Ciekaw jednak jestem gdzie można kupić Canada Balsam (mój się kończy), czy powinien spełniać jakieś warunki? I na jakim plastiku robić preparaty w balsamie (odporność na ksylen i inną chemię, przejrzystość)? Jakiś patent Pawle? 20 lat temu to były wkładki pod kołnierzyki koszul - może dzisiaj jest dostępny jakiś dobry, stale dostępny materiał?
-------------------------------------------------------------------------------------
Dostępność materiałów wykorzystywanych w technikach mikroskopowych ( i histologicznych ) często uniemożliwia wykonanie przez młodego adepta mikroskopowania preparatów mikroskopowych. Balsam kanadyjski - oczyszczona żywica z sosen kanadyjskich - jest trudno dostępny Technika pracy z tą substancją jest trudna gdyż wymaga odwodnienia materiału, balsam długo twardnieje, podczas obróbki materiału wykorzystywane są trudno dostępne i toksyczne substancje w stylu ksylen, aceton, szereg alkoholi łącznie z alkoholem absolutnym, czyli bezwodnym. Istnieje kilka alternatywnych technik, dużo prostszych i tańszych. Ich podstawą jest ominięcie procesu odwadniania, który w przypadku przygotowywania preparatów barwionych występuje dwa razy. Odwadnianie jest niezbędne podczas stosowania balsamu kanadyjskiego gdyż nie miesza się on z wodą. Szereg alkoholi, aceton, ksylen mają na celu odwodnienie materiału i przepojenie go substancjami rozpuszczającymi się ( mieszającymi się ) z balsamem ( benzen, ksylen i inne rozpuszczalniki aromatyczne ). Alternatywą dla balsamu jest syntetyczna substancja o symbolu DPX. Jest ona tańsza od żywicy naturalnej, ale wymaga takiego samego ciągu przygotowań materiału do zatopienia. Alternatywa dla amatorów to substancje mieszające się w sposób nieograniczony z wodą. Osobiście stosowałem roztwór glinokrzemianów w wodzie (tzw. szkło wodne ), 86 % roztwór glicerolu w wodzie, mieszaninę gliceryny i żelatyny (żelatoglicerynę ). Do zatapiania preparatów w stylu rozmaz krwi lub barwienie bakterii dobry jest olejek immersyjny lub jego zamiennik - zwykły olejek rycynowy. Wszystkie te substancje są powszechnie dostępne ( ze szkłem wodnym mogą być problemy i tanie, mają w miarę przyzwoite wsp. załamania światła, co jest istotne przy małych obiektach i dużych powiększeniach. W przypadku stosowania substancji płynnych (olej, roztwór glicerolu) konieczne jest boczne uszczelnienie obrzeża szkiełka nakrywkowego (inaczej robienie preparatu mija się z celem). Do tego celu dobry jest lakier poliuretanowy, kleje ( żywice) epoksydowe o długim ( 24 h) czasie polimeryzacji (te o krótkim czasie strasznie się mażą i są dalekie do tego, co zwie się estetyką) lub zwykły butapren.
--------------------------------------------------------------------------------------
Ja nigdy nie preparowałem kopulatorów, raczej wykonywałem maceracje okazów ( Ixodidae, Argasidae, Anoplura, Sarcoptes i in>) w KOH ewentualnie w kwasie mlekowym na ciepło bądź zimno, w zależności od wielkości okazu, potem płukanie tudzież usunięcie zmacerowanych wnętrzności ( głównie Ixodidae, Pulicidae) pod lupa potem płukanie i odwadnianie i zatapianie. tutaj oczywiście problemy z balsamem kanadyjskim, ale bardzo dobrze sprawdzał się płyn Hoyera, żelato glicerol. te media żeby nie wysychały obwodzę bezbarwnym lakierem do paznokci. Natomiast nowym z mediów jest zaadoptowany Histofluid. co prawda przeznaczeniem jego jest zatapianie preparatów histologicznych, ale się nadaje, szybko schnie łatwo się nawarstwia na preparat. sporządzenie dobrego preparatu to sztuka, i to prawdziwa
-------------------------------------------------------------------------------------
Swoją drogą, opisywanie preparatyki kopulatorów to trudna sprawa, jest w tym masę sztuczek technicznych związanych np. z przenoszeniem delikatnych obiektów o rozmiarach czasem dziesiątych części milimetra; samo wyjęcie czegoś takiego z probówki bez pokazania tychże sztuczek może początkującemu wydać się nie do zrobienia... Ja czasem preparuję np. elementy aparatu gębowego z okazu o długości pół milimetra, nie zgubić tego w czasie odwadniania to jest dopiero wyzwanie... Najlepiej takie rzeczy jednak pokazać.
Krótki opis preparacji kopulatorów motyli znajdziesz tutaj:
http://www.lepidoptera.slask.pl/badania.html
-------------------------------------------------------------------------------------
BADANIE NARZĄDÓW ROZRODCZYCH MOTYLI
Aby zbadać aparat kopulacyjny motyla potrzebny nam jest mikroskop stereoskopowy (binokular) o powiększeniu najmniej 50x, probówki, igły preparacyjne, szkiełka podstawowe i nakrywkowe oraz pewne odczynniki chemiczne. Najpierw odcinam cały odwłok motyla (dlatego, że u niektórych gatunków aparat genitalny zajmuje całą długość odwłoka). Jeśli jest to suchy okaz, to igłą preparacyjną odłamuję odwłok przytrzymując tułów motyla, aby się nie odłamał razem z odwłokiem. Następnie umieszczam odwłok w dość szerokiej probówce i wlewam niewielką ilość 10% roztworu ługu sodowego (NaOH) lub potasowego (KOH). Potem ogrzewam probówkę nad palnikiem gazowym przez kilka minut, uważając aby zawartość się za bardzo nie gotowała, bo może się wylać. Nigdy nie trzymaj ogrzewanej probówki na ogniu w swoim kierunku, bo to grozi poparzeniem! Zalewam probówkę wodą i kładę na jasnym talerzu, aby odwłok wylał się wraz z wodą na talerz, co skutecznie zapobiega wylaniu się go do zlewu. Potem trzeba odwłok umieścić w kropli wody na szkiełku podstawowym pod mikroskopem. Następnie, używając igieł preparacyjnych oddzielam aparat kopulacyjny od odwłoka. U samca jest to dość łatwe, u samicy często trzeba przeciąć odwłok między VII a VIII segmentem, by wynicować aparat kopulacyjny z odwłoka. Jeśli są problemy z oddzieleniem tkanek miękkich od aparatu kopulacyjnego, to trzeba macerowanie odwłoka powtórzyć, jednak z wyczuciem - gdyż, jeśli przesadzisz z podgrzewaniem, to możesz cały narząd rozrodczy rozgotować. Teraz już można aparat badać, opisywać, rysować. Trzeba jednak pamiętać, żeby obiekt badawczy był zawsze w kropli wody, bo inaczej wyschnie i nie będzie się do niczego nadawał.
Następnie należy z aparatu kopulacyjnego wykonać trwały preparat mikroskopowy. Najpierw układam aparat w odpowiedniej pozycji, zależnie od tego, jakie cechy są ważne dla identyfikacji gatunku. Często się zdarza, że jest problem z otwarciem, rozłożeniem walw u samca. Ja mam na to taki sposób, że umieszczam aparat w kropelce miodu, wtedy o wiele łatwiej jest rozewrzeć walwy w żądany sposób. Potem obiekt trzeba odwodnić czystym spirytusem (żadnym salicylowym itp., bo one posiadają zanieczyszczenia). Dalej usuwam ligniną spirytus i zalewam preparat ksylenem. Po usunięciu ksylenu dodaję na szkiełko kroplę balsamu kanadyjskiego (żywicy z jodły kanadyjskiej) i kładę na nią kawałek szkiełka nakrywkowego. Zamiast balsamu kanadyjskiego można też stosować Euparal, który jest żywicą syntetyczną. Taki preparat zostawiamy na kilka dni, aby wysechł, potem można go przechowywać przez dziesiątki lat bez jakichś większych zmian.
Pozostaje nam jeszcze jedna bardzo ważna sprawa. Każdy preparat musi mieć etykietę. Ja stosuję papier samoprzylepny, wielkości cenówek. Przyklejam dwie etykietki, po obu stronach preparatu. Na jednej umieszczam nazwę rodziny, gatunku oraz miejsce i datę złowienia. Na drugiej wpisuję numer preparatu (taki sam umieszczam pod okazem motyla), nazwisko preparatora oraz zastosowany środek zamykający. Zbiór preparatów należy przechowywać w odpowiednich pudełkach.))
-------------------------------------------------------------------------------------
O preparowaniu kopulatorów czy spermatek z małych okazów
Paweł Jałoszyński
Narzędzia:
1) minucje osadzone w zapałkach - dwie sztuki, akurat jedną mam prostą a druga się nieco na końcu zagięła, co bardzo pomaga, ale w tej chwili jest mi w zasadzie obojętne, dwie proste też mogą być;
2) naczynia do rozpuszczalników - jak już pisałem, u mnie to są kapsle od polietylenowych PCR-ówek, średnica ok. 5-6 mm, akurat mam cztery sztuki przyklejone "w kwadrat" balsamem kanadyjskim do szkiełka podstawowego, a teraz właśnie zrobiłem sobie taki zestaw na dużej szalce Petriego, co ma tę zaletę, że trudniej się gubi w bałaganie i cokolwiek by się na szkle nie położyło nie spadnie poza krawędź. W zasadzie używam dwóch z tych naczyń - do jednego kropla izopropanolu, do drugiego ksylenu; dwa pozostałe są rezerwowe. Co jakiś czas trzeba wywalić i zrobić nowe - nie opłaca się tego czyścić.
3) standardowe wyposażenie i materiały, czyli binokular, pipeta, duże szpilki, balsam itd.
Niezależnie od tego czy okaz jest dopiero co zabity czy też rozwilżony zawsze preparuję w kropli wody pod binokularem. Ten etap to jest kwestia zręczności i precyzji rąk, więc każdy musi sobie sam poćwiczyć. Czasami łatwiej wyciąga się co trzeba jak okaz jest nogami do góry, czasami normalne. Sam okaz przytrzymuję jedną minucją a w odwłoku dłubię drugą; czasem da się łatwo wyciągnąć kopulator, a czasem trzeba oderwać odwłok. W przypadku spermatek odwłok zawsze trzeba urwać, a czasami niestety spermateka kryje się głęboko w tułowiu (jak u niektórych Scydmaenidae) i łatwo ją zgubić (to są obiekty o średnicy rzędu dziesiątych części milimetra), trzeba się nieźle naszukać gdzie to cholerstwo jest. Jak już to, co trzeba jest wyciągnięte i jako tako oczyszczone z ewentualnych przylepionych śmieci to obydwoma minucjami wyciągam to z wody (to jest niezła akrobacja, nie zawsze da się za pierwszym razem) - dokładniej obiekt (fiut czy spermateka) jest w kropli wody uwięzionej pomiędzy końcami szpilek (czasem da się i jedną szpilką, to już jak samo wyjdzie). Przenoszę obiekt do izopropanolu (szkło z "naczyniami" jest obok binokularu); tutaj trzeba bardzo uważać czy na pewno to, co się przenosi spadło ze szpilki w rozpuszczalniku. Wracam do chrząszcza pływającego w kropli wody pod binokularem - wyciągam go (też minucjami) na leżącą obok binokularu bibułę, razem z np. oderwanym odwłokiem. Ścieram kroplę wody ze stolika binokularu i osuszonego chrząszcza przekładam (znowu minucje, ale jak ktoś ma delikatne ręce to może być pęseta) pod binokular i naklejam na kartonik (metodą może mało tradycyjną, ale skuteczną - okaz na kroplę kleju na kartoniku kładę za pomocą dużej, dopiero co ...polizanej szpilki. To oczywiście kwestia wprawy i przyzwyczajeń, trzeba uważać, żeby nie ufajdać okazu, alternatywą jest oczywiście pęseta albo wilgotny pędzelek, co kto lubi. OK, okaz przyklejony, kartonik naszpilony i odłożony na bok, powrót do odwadniającego się w tym czasie fiuta. Przenoszę moją szalkę Petriego na stolik binokularu i sprawdzam czy przypadkiem fiut nie jest zapowietrzony (rzadko przy świeżych okazach, prawie zawsze przy rozwilżanych). Jeśli jest, to przekładam go minucjami do PCR-ówki z ksylenem do następnego dnia, zwykle to wystarcza do całkowitego odpowietrzenia.
Technika wyciągania fiuta z tej probówki też może być warta paru słów - odwracam probówkę dnem do góry tak, żeby obiekt spłynął na kapsel, po czym znowu odwracam probówkę - obiekt powinien zostać pod kapslem (nie zawsze tak jest, ale przy odrobinie wprawy wystarczająco często). Bardzo ostrożnie otwieram probówkę (trzeba uniknąć odskoczenia kapsla, bo fiut się katapultuje i już go nigdy nie znajdziemy...). Kapsel PCR-ówki jest z boku połączony z samą probówką, więc można go odemknąć o 90 stopni w stosunku do długiej osi probówki - wtedy kładę probówkę pod binokular kapslem na stolik i patrzę czy obiekt jest na kapslu czy nie. Jak nie to zamykam i operację z obracaniem powtarzam do skutku. Bardzo rzadko nie daję rady umieścić obiektu na kapslu i wtedy pozostaje dość karkołomna operacja - obiekt jest w ksylenie na dnie probówki, widać to patrząc w otwartą probówkę pod binokularem, i po odwróceniu uparcie przy tym dnie pozostaje, więc w odwróconej pozycji (fiut cały czas przy dnie) otwieram probówkę nad bibułą, żeby pozbyć się ksylenu, odwracam, odcinam nożyczkami samo dno na jakieś 5 mm i z tego już łatwo minucjami wyciągam obiekt. Brzmi może na skomplikowaną operację, ale w rzeczywistości jest bardzo proste, i w dodatku taka konieczność zdarza mi się bardzo rzadko, zwykle jednak fiut zostaje pod kapslem przy odwracaniu probówki. No dobrze, wracamy do sytuacji takiej, że po obejrzeniu obiektu w izopropanolu pod binokularem okazał się on całkowicie odpowietrzony. Wtedy minucjami przenoszę go do sąsiadującego naczynia z ksylenem i zostawiam tam na pół minuty czy minutę, w każdym razie takie czasy wchodzą w grę. Oczywiście im większy obiekt tym dłużej trzeba go odwadniać w izopropanolu, a potem najlepiej przenieść do kolejnej porcji tego samego środka, żeby pozbyć się śladów wody, i dopiero potem do ksylenu. Przy fiutach mających o. 0,5 mm nie ma takiej potrzeby, jedno moczenie w izopropanolu i jedno w ksylenie wystarcza. W czasie, jak fiut jest w ksylenie, wycinam sobie prostokąt z plastiku i kładę go na szalce blisko naczynia z ksylenem. Za pomocą zwykłej (tj. dużej) szpilki nakładam na plastik kroplę balsamu (trzeba pamiętać o wycieraniu szpilki, żeby jej potem do czegoś nie przykleić). W balsamie maczam koniuszek minucji i szybko (i b. delikatnie) dotykam obiektu w ksylenie tak, żeby się przylepił. To trzeba robić bardzo sprawnie, bo kropla balsamu w ksylenie szybko się rozpuści. To znowu kwestia wprawy, zwykle wychodzi za pierwszym razem - obiekt przylepiony do balsamu na szpilce przenosimy z ksylenu do medium na plastiku. Wsadzanie obiektu do kropli balsamu kontroluję pod binokularem (plastik i naczynia są na szalce Petriego, wystarczy ją przesuwać, żeby widzieć pod binokularem, co się robi). Ważne, żeby obiekt był całkowicie zatopiony, bez zbędnych pęcherzyków powietrza. Jeśli trzeba, to na preparat daję kropelkę ksylenu (łebkiem dużej szpilki), co pomaga zatopić obiekt. Plastik podpinam na szpilkę pod okazem; na drugi dzień poprawiam pozycję obiektu w balsamie kładąc znowu kropelkę ksylenu i pozycjonując obiekt minucją.
I na koniec użyteczna technika poszukiwań małych obiektów na podłodze - czasem nam coś spadnie, nie musi to być odstrzelony ze sprężynującej szpilki kopulator, może być cały okaz, jakiś brązowy mikrus pod stołem, tragedia... Jak to odnaleźć? Bierze się arkusz wilgotnej ligniny i kładzie na podłodze... Wszystkie paprochy się przyklejają i teraz wystarczy przejrzeć ligninę pod binokularem.... Czego nikomu nie życzę...
Wiem, że chaotycznie, ale zawsze można dopytać o niejasne szczegóły.
Oznaczanie na podstawie cech budowy kopulatorów jest obecnie stałą praktyką w entomologii. Wymaga ono zazwyczaj przygotowania preparatów mikroskopowych, a to jest dość praco- i czasochłonne. W celu rutynowych oznaczeń, jako medium prześwietlające i odwadniające wykorzystać można dioksan (uwaga — trujący!), a jako medium zamykające balsam kanadyjski lub inną (syntetyczną) żywicę, np. CeDeX (metodę przygotowania preparatów z wykorzystaniem dioksanu podał w jednym z zeszytów kluczy do kusaków Prof. A. Szujecki). Prof. R. Szadziewski (muchówkarz) swego czasu zdradził mi metodę przygotowania preparatów, którą On stosuje: prześwietlenie w fenolu (bardzo trujący!!!), wypłukanie, ewentualne odwodnienie w alkoholu (etanol, izopropanol) i zamknięcie w medium (jeżeli preparat nie był odwadniany, to na przykład w Euparalu, poliwinyllaktofenolu lub glicerożelatynie; jeżeli go odwodniliśmy — w żywicy typu balsam kanadyjski).
Stosowanie dioksanu lub fenolu pozwala uniknąć potrzeby macerowania tkanek miękkich za pomocą roztworów NaOH lub KOH; w przypadku kopulatorów jest to bardzo korzystne!
Niekiedy preparaty mikroskopowe są tak prześwietlone, że często trudno jest dostrzec cechy istotne. W takich przypadkach preparaty należy podbarwić. Technikę barwienia preparatów opisał w kluczu do biedronek R. Bielawski.
Oczywistym jest, że w przypadku okazów o dużej wartości, które włączamy do zbiorów preparaty narządów genitalnych powinny być trwałe i podpięte pod okaz, z którego je wypreparowano. Zamiast podkładek plastikowych stosuję skrawki szkiełek nakrywkowych o wymiarach od 6 x 6 mm, które naklejam na prostokątne kartoniki z dziurką (średnica około 4 mm) przy końcu. Preparat przykrywam drugim skrawkiem szkiełka nakrywkowego.
Jak ciąć szkiełka nakrywkowe? Bardzo prosto. Za pomocą oprawionego w oprawce igły preparacyjnej ziarna korundu (te bierzemy z gruboziarnistego papiery ściernego) lub pióra diamentowego (niestety, bardzo drogie…) delikatnie zarysowujemy szkiełko nakrywkowe, a następnie łamiemy je. Po zniszczeniu kilku szkiełek następne będziemy kroić jak masło!
Polecam zawsze przykrywać preparaty mikroskopowe szkiełkami nakrywkowymi. W ten sposób unikniemy zniekształceń obrazu powstających na skutek oddziaływania krzywizn medium zamykającego.
Inną, niezmiernie interesującą i dającą wspaniałe wyniki sprawą jest wynicowywanie endophallusa. Ale to już inna historia…
Jeszcze trochę o przygotowywaniu preparatów mikroskopowych. Jak zmieniać płyny podczas preparowania? Zależy to w dużej mierze od wielkości preparowanego narządu. Jeżeli jest on dość duży, stosować można małą pipetkę lub nawet zakraplacz. Zmiana płynów w przypadku małych obiektów jest bardzo prosta. Preparat taki najlepiej przygotowywać na szkiełku przedmiotowym z łezką, a płyny zmieniamy w ten sposób, że odciągamy je skrawkiem bibuły. Z zakraplaniem nie powinno być chyba kłopotu
-------------------------------------------------------------------------------------
Trochę mi się włos zjeżył... Byłbym bardzo daleki od zachęcania kogokolwiek do pracy z fenolem czy dioksanem w warunkach domowych. Oparzenia fenolem potrafią się goić latami (wiem co mówię, pracuję z fenolem na codzień, a i oparzyć się zdarzyło), opary działają drażniąco na błony śluzowe, nie daj Boże robić coś z fenolem w domu, w którym są dzieci.... Dioksan jest łatwopalny, zaleca się przechowywać go pod azotem, bo jeśli jest bezwodny to powoli reaguje z tlenem z powietrza tworząc nadtlenki, które mają przykrą właściwość wybuchania w nieodpowiednich momentach... To jest bardzo nieprzyjemna trucizna, powoduje uszkodzenie wątroby i nerek i zaburzenia funkcjonowania układu nerwowego, jest też mutagenem i kancerogenem. Zdecydowanie odradzam eksperymentowanie z tymi związkami w domu; chyba, że ktoś ma dobre przygotowanie chemiczne i dokładnie wie co robi (albo i tak ma raka i już mu wszystko jedno...). Osobiście nie odważyłbym się używać dioksanu w innych warunkach niż pod dobrze działającym wyciągiem; z fenolem mam dużą (wieloletnią) praktykę i też w domu bym go nawet nie trzymał...
Euparal tylko za granicą. Za duże dość pieniądze - około 200 zł. za butelkę 100 g. i niewiele mniej za taką samą porcję esencji euparalu. Balsam kanadyjski pewnie można dostać w Polsce, ale nie mam na ten temat żadnych informacji. Poczekajmy na posty innych.
W praktyce preparowania kopulatorów Euparal jest powszechnie uważany za lepszy
Odmaczanie
Ja stosuje dwie metody w zależności od wielkości chrząszcza i jego delikatności. Gdy są to okazy małe (tak poniżej 1 cm, ale to też zależy od stopnia sklerotyzacji) i delikatne to wrzucam je do octu (takiego zwykłego ze sklepu - 10%) i podgotowuje to pierwszego lekkiego wrzenia, ale trzeba bardzo uważać by nie przegapić momentu, kiedy należy przestać gotować chrząszczyka gdyż inaczej ciśnienie wysadza skrzydła spod pokryw i trudno je potem z powrotem włożyć, więc obserwuje gotującego się chrząszcza i gdy pojawią się pierwsze bąbelki powietrza i zaczyna ocet parować szybko go wyciągam, to rozmiękczanie trzeba trochę wyćwiczyć sobie, właśnie ze względu na omówiony powyżej moment. Duże chrząszcze natomiast i mocno zesklerotyzowane po prostu wrzucam na parę chwil do wrzątku.
-------------------------------------------------------------------------------------
Z tym octem to ciekawa sprawa. Ja go stosuję do wstępnego nawilżenia owada przed wrzuceniem do benzyny na dłuższy okres czasu (taka nowa metoda przechowywania . Chodzi o to, że benzyna (ekstrakcyjna) "wysusza" nieco owada, czyli przed włożeniem należy wyposażyć go w wodę. Oczywiście można to zrobić i po wyjęciu, ale lepiej wyjmować z benzyny elastyczne okazy. A więc reasumując: ocet dobrze nawilża, utrzymuje wodę w ciele owada i przy okazji zapobiega procesom gnilnym. Ale tej metody z nawilżaniem nie znałem. Dzięki. Jacek Kurzawa
-------------------------------------------------------------------------------------
Moje doświadczenia na ten temat są następujące:
- powolne rozwilżanie w temperaturze pokojowej jest możliwe, ale należy do wody w pojemniku dodać trochę octu - niskie pH zapobiega wzrostowi większości mikroorganizmów przez dość długi czas
- przedłużyć można rozwilżanie, jeśli pojemnik trzyma się np. w lodówce (w niskiej temperaturze mikroby też wolniej rosną)
- do wody gdzieś na minimum noc wkładam także świeżo zatrute chrząszcze - znakomicie miękną stawy, odnóża i czułki lepiej się układają; także woda odmywa nieco wydzielin, którymi niekiedy owad pokrywa się podczas zatruwania
- teraz często nawet nie wkładam owada bezpośrednio do cieczy, ale nawilżam leżącego na kawałku kartonu wpiętego w pojemniku ponad lustro płynu; wysoka wilgotność w pojemniku często jest wystarczająca, aby owad już po jednej, dwóch dobach nadawał się do rozpinania.
Oczywiście, pojemnik zawsze jest zamknięty od góry.
Trudne jest niekiedy odwilżenie okazów, które były uprzednio odtłuszczone kąpielą w np. ksylenie, czy octanie etylu. Wówczas podczas odwilżania z ciała owada niekiedy wypływają jakieś "zawartości", które osadzają się np. na włoskach tułowia, czy odwłoka.
Z innych owadów:
próbowałem rozwilżać wysuszone cykady, ale ich błoniaste skrzydła nie były gładkie (jakby napięte), lecz wyraźnie się marszczyły - efekt ten nie znikał po ponownym wysuszeniu.
A tak poważnie, to ja na zimno już od lat niczego nie rozwilżam, drobnym okazom (większość materiału, którym się zajmuje) wystarczają 2 min. w gorącej wodzie destylowanej (gorąca, to jest taka, kiedy mogę w nią palec wsadzić bez obawy o pobicie rekordu w skoku wzwyż, maks. jakieś 50-60 stopni). Najlepiej raczej większą objętość, czyli np. szklanka, żeby rozpuszczający się klej z kartonika się rozcieńczył i nie ufajdał włosków okazu (nawet płukać nie trzeba). Jak się używa wody z kranu, to dość często takie maluchy po wyschnięciu maja nalot z tego całego syfu, który się z wody wytrąca (czyli głównie kwaśne węglany wapnia i magnezu). Duże, ciemne zwierzaki z gruba chityna spokojnie można wrzucić do wrzątku, jak napisał Marek. Raz, ze szybko, dwa, ze wystarcza to za dezynfekcje. Odrobina octu dolana do takiej kąpieli znakomicie poprawia elastyczność okazu. Normalnie kwas octowy ma działanie obkurczające tkanki, wiec dodaje się go do różnych utrwalaczy alkoholowych, żeby równoważył spęczniające właściwości etanolu, co pozwala zachować okazy bez niepotrzebnych deformacji. Przy rozwilżaniu suchego materiału ocet przyspiesza penetracje roztworu do tkanek, poprawia tez (choć czasem trudno to zauważyć) zblaknięte kolory u niektórych chrząszczy.
-------------------------------------------------------------------------------------
Po pierwsze, tymol jest ciałem stałym, wiec sprzedaje się go nie na mililitry, tylko na gramy. Po drugie, jedynym działaniem tymolu jest zabijanie grzybów, i do tego celu wystarczy mikroskopijny, ledwo widoczny gołym okiem kryształek wrzucony do szklanki cieplej wody. Tymol ma bardzo małą rozpuszczalność w wodzie, ale to, co z takiej malej ilości zdoła się rozpuścić w zupełności wystarcza do ochrony przed grzybami. Lepiej jest zresztą spryskać wnętrze szafy na gabloty etanolowym roztworem tymolu (wystarczy stężenie rzędu 0,1-0,5%). Rzecz jest powszechnie znana, ale u nas wilgotność powietrza nie jest aż tak duża, żeby pleśń była wielkim problemem, wiec w zasadzie nikt tego nie stosuje (może częściej w zielnikach). Typowo kryształek tymolu wkłada się do probówek z suchym materiałem, który ma długo leżeć, albo do kopert; na pewno nie zapleśnieje. Trzeba pamiętać, ze Tymol sublimuje i po jakimś czasie cały wyparuje; wiec daje się go tyle, żeby łatwo wyczuć jego zapach (a właściwie czas, kiedy już tego zapachu nie ma).
To, co piszesz o "poprawianiu parowania wody" to bzdury.
Zupełnie nie rozumiem tych udziwnionych patentów - całe życie rozwilżam okazy w wodzie o temp. ok. 60 st. C z odrobiną octu i jeszcze mi się nie zdarzyło, żeby trwało to dłużej niż 20 minut, niezależnie od wielkości.
Na szalce Petriego kładę ligninę lub biały papier toaletowy (ważne by zawierał jak najmniej dodatków poza ligniną, najlepiej same włókna bez wybielaczy i innych udziwnień). Na tym układam okazy do odwilżenia i wkraplam wodę (koniecznie destylowaną, szczególnie, gdy okazy mają kilka mm). Dodatkowo kropla czy dwie octu nie zawadzi. Malutkie chrząszczyki są gotowe do preparowania po kilkunastu minutach, większe po kilku godzinach.
Uwaga: zauważyłem, że jakkolwiek wyższa temperatura trochę przyśpiesza rozmiękanie okazu to ustawienie w/w szalki z okazami pod np. żarówką może dać efekt przeciwny. Co prawda szalka zdrowo zaparuje, ale okazy (szczególnie małe) wewnątrz wyschną! Podobnie traktowanie okazu gorącą parą wodną często zmienia jego barwę (przyciemnia okaz).
Osobny temat to okazy sprężyste. Ze względu na chroniczny brak czasu nie mocuję się z nimi, lecz naklejam na trójkąt. Przy większych okazach można się pokusić o "gimnastykę" okazu.
Ciekawi mnie natomiast temat przyczyn sprężystości okazu. Często jest to cała próbka z danego stanowiska. Zauważyłem, że najczęściej sprężyste są okazy, które zbyt długo (w stresie) przebywały niestrute (niedotrute) w zatruwaczce, często ze swoimi naturalnymi drapieżcami. I częściej sprężyste są samce (bardziej wrażliwe na stres??).
To tyle moich spostrzeżeń. Co na temat sprężystości okazów sądzą inni??
-------------------------------------------------------------------------------------
Cóż amoniak przechowuje w naczyniu ze szlifem, kto miał laborki z chemii wie, co to jest, a w czasie odmaczania owadów nie wkładam do tego amoniaku paluchów. co to zmiany barw, nie zauważylem większych zmian, choć nie wykluczone, że niektóre gatunki mogą mieć do tego tendencje. Co do trwałości to na bieżąco nie widzę nic szczególnego, jak owady rozmaczane będą się zachowywać za 10-15 lat zobaczymy.
Robię czasami do stu preparatów dziennie, przeważnie typowo "kopulatorowe" na kawałku plastiku podpiętym pod okaz, rzadziej preparaty na szkiełkach. Balsam, balsam i jeszcze raz balsam! Odwodnienie - banalna rzecz - na szkiełku podstawowym mam przyklejone małe, plastikowe (polietylenowe) odcięte kapsle od PCR-ówek (takie małe, plastikowe probówki do PCRu, jakby ktoś nie wiedział to niech sobie w sieci poszuka), przyklejone oczywiście odwrotnie, co daje małe i wygodne zbiorniki na izopropanol i ksylen. Preparuję w kropli wody, obiekt przenoszę na jakąś minutę do izopropanolu, potem na równie krótko do ksylenu i jeśli nie jest zapowietrzony od razu do balsamu. Na drugi dzień sprawdzam położenie, jeśli trzeba nakładam kropelkę ksylenu (łebkiem od szpilki) i poprawiam obiekt; czasem trzeba tak kilka razy. Jeśli obiekt jest zapowietrzony to na zdjęciu mojego warsztatu w innym wątku widać kawałek styropianu z baterią kilku rzędów PCR-ówek - są one ponumerowane i zawierają ksylen albo izopropanol (czasem odpowietrzam w izopropanolu i potem przenoszę do ksylenu, czasem jest konieczność odklejenia czegoś i po to sam ksylen). Wkładam preparat do odpowiedniej probówki, pod okaz na szpilkę wędruje numer, żeby się nie pogubić (często odpowietrzam kilkadziesiąt kopulatorów). Przeglądam na drugi dzień, zwykle już jest odpowietrzone, rzadko trzeba trzymać dłużej.
Jeśli ma to być preparat na szkiełku mikroskopowym, to zasada jest ta sama, tylko trzeba pamiętać, że medium (niezależnie, co to będzie, może za wyjątkiem glicerożelatyny, ale to do trwałych się nie nadaje) wysychając przyciągnie szkiełko nakrywkowe do podstawowego i może zmiażdżyć preparat. Ja zawsze używam dwóch wąskich pasków plastiku (zwykle polipropylen) jako przekładek wzdłuż boków szkiełka nakrywkowego.
I parę słów o mediach - balsam kanadyjski ma długą tradycję stosowania i jest pewne, że przynajmniej przez sto lat nic złego się z preparatem nie stanie. Małe minusy są dwa - preparaty na plastiku trzymane przez lata w atmosferze p-dwuchlorobenzenu (jeśli ktoś tego używa) ciemnieją, stają się ciemnożółte (ale nie zmienia to przejrzystości, wszystko dobrze widać); i balsam jest sztywny i kruchy, chwila nieostrożności, wygięcie plastiku i kropla z preparatem może odpaść (rzadko, ale jednak ze dwa-trzy razy tak mi się stało, raz nawet w przypadku holotypu Schaufussa, co ja się naszukałem tego cholerstwa...).
Euparal - krótsze stosowanie, ale też najstarsze preparaty są w dobrej kondycji. Problemy - są różnej jakości preparaty euparalu, minimalnie różniące się właściwościami. To jest jakiś patent, ale jednak to, co np. kupowałem w Japonii różni się nieco od euparalu niemieckiego, z którym wcześniej miałem do czynienia. Euparal ma tendencję do pękania w czasie schnięcia, widziałem takie preparaty (w tym typy), w których pęknięcie przebiegało dokładnie przez kopulator... Mniejsza lepkość niż balsamu - trudniej wypozycjonować obiekt wymagający precyzyjnego położenia - ważne przy np. takich kopulatorach jak u Pselaphinae czy Scydmaenidae, gdzie przekręcenie na bok o parę stopni bywało w przeszłości podstawą do opisywania nowych rodzajów. Dużo łatwiej pozycjonować takiego fiuta w balsamie. Euparal natomiast świetnie się nadaje do kopulatorów (czy innych obiektów) płaskich, które same się rozkładają; np. jak muszę narysować skrzydło to tylko z euparalu (skrzydła takich maluchów to w ogóle osobna historia...). Wszystkie inne media radzę jednak traktować jako przejściowe, ostatecznie lepiej przełożyć do balsamu; szczególnie dotyczy to mediów opartych na wodzianie chloralu, które po wielu latach tak przyciemniają preparat, że staje się on bezużyteczny. Gliceryna (czysta, 100%) w zamkniętych szczelnie fiolkach jest OK. Problem jest z tą szczelnością - gliceryna jest silnie higroskopijna, ciągnie wodę z powietrza. To oznacza, że jeśli fiolka nie będzie idealnie szczelna to gdzieś na brzegach korka pojawi się rozcieńczony (właśnie wodą z powietrza) roztwór, który razem z drobinami kurzu jest świetną pożywką dla grzybów (takie np. Penicillium glaucum potrafi wyrosnąć w słoiku z miodem, to taki skrajny przykład organizmu, dla którego granica ciśnienia osmotycznego nadającego się jeszcze do życia jest bardzo przesunięta w stronę nieakceptowalną przez większość grzybów). I prędzej czy później grzyb weźmie się za nasz cenny preparat. Nie nastąpi to w ciągu roku czy dwóch, ale pod holotypem fiolki z gliceryną bym nie podpiął; tylko balsam.
To tak w wielkim skrócie z własnego doświadczenia (zrobiłem ładnych parę tysięcy preparatów) i literatury (kiedyś próbowałem sam się dowiedzieć co nieco na temat trwałości mediów, dotarłem nawet do informacji o muzeach, które przeznaczyły kupę forsy na przełożenie wielkich zbiorów z medium Hoyera do balsamu!!!).
Paweł Jaloszyński
--------------------------------------------------------------------------------------
Co do jednego Paweł ma na pewno rację, materiał typowy powinien być dobrze zabezpieczony i tu pewnie trzeba myśleć o balsamie.
Jednak do celów roboczych, oznaczania, dla zachowania struktury przestrzennej lub miękkich części kopulatora oraz jeżeli potrzebujemy obracać i oglądać preparat z różnych stron gliceryna jest dobrym wyjściem. Ja właśnie używam PCR'ów 0.2, gliceryna jest w nich utrzymywana w końcu pojemnika, jest dosyć mały, dobrze podpina się na szpilkę. Przez pewien czas dostawałem zużyte PCRy, cena przy zakupie niestety jest sporo większa niż zwykłych większych eppendorfów.
W niektórych sklepach (USA, Europa) są dostępne MicroVials o takim właśnie zastosowaniu, niestety cena też jest spora. Słyszałem, że niektórzy stosują różnego rodzaju rurki o małym przekroju, zasklepiane termicznie z jednej strony, ale tego ze względu na uwagi podane przez Pawła raczej nie należy polecać. Ale to dotyczy wszystkich otwartych pojemników.
Kiedyś odbyła się na jednym z wątków dyskusja o potencjalnej szkodliwości chemii. Swego czasu krążyły informacje o rakotwórczości ksylenu. Był to jeden z powodów, dla których drastycznie zmniejszyłem używanie balsamu.
-------------------------------------------------------------------------------------
Ciekaw jednak jestem gdzie można kupić Canada Balsam (mój się kończy), czy powinien spełniać jakieś warunki? I na jakim plastiku robić preparaty w balsamie (odporność na ksylen i inną chemię, przejrzystość)? Jakiś patent Pawle? 20 lat temu to były wkładki pod kołnierzyki koszul - może dzisiaj jest dostępny jakiś dobry, stale dostępny materiał?
-------------------------------------------------------------------------------------
Dostępność materiałów wykorzystywanych w technikach mikroskopowych ( i histologicznych ) często uniemożliwia wykonanie przez młodego adepta mikroskopowania preparatów mikroskopowych. Balsam kanadyjski - oczyszczona żywica z sosen kanadyjskich - jest trudno dostępny Technika pracy z tą substancją jest trudna gdyż wymaga odwodnienia materiału, balsam długo twardnieje, podczas obróbki materiału wykorzystywane są trudno dostępne i toksyczne substancje w stylu ksylen, aceton, szereg alkoholi łącznie z alkoholem absolutnym, czyli bezwodnym. Istnieje kilka alternatywnych technik, dużo prostszych i tańszych. Ich podstawą jest ominięcie procesu odwadniania, który w przypadku przygotowywania preparatów barwionych występuje dwa razy. Odwadnianie jest niezbędne podczas stosowania balsamu kanadyjskiego gdyż nie miesza się on z wodą. Szereg alkoholi, aceton, ksylen mają na celu odwodnienie materiału i przepojenie go substancjami rozpuszczającymi się ( mieszającymi się ) z balsamem ( benzen, ksylen i inne rozpuszczalniki aromatyczne ). Alternatywą dla balsamu jest syntetyczna substancja o symbolu DPX. Jest ona tańsza od żywicy naturalnej, ale wymaga takiego samego ciągu przygotowań materiału do zatopienia. Alternatywa dla amatorów to substancje mieszające się w sposób nieograniczony z wodą. Osobiście stosowałem roztwór glinokrzemianów w wodzie (tzw. szkło wodne ), 86 % roztwór glicerolu w wodzie, mieszaninę gliceryny i żelatyny (żelatoglicerynę ). Do zatapiania preparatów w stylu rozmaz krwi lub barwienie bakterii dobry jest olejek immersyjny lub jego zamiennik - zwykły olejek rycynowy. Wszystkie te substancje są powszechnie dostępne ( ze szkłem wodnym mogą być problemy i tanie, mają w miarę przyzwoite wsp. załamania światła, co jest istotne przy małych obiektach i dużych powiększeniach. W przypadku stosowania substancji płynnych (olej, roztwór glicerolu) konieczne jest boczne uszczelnienie obrzeża szkiełka nakrywkowego (inaczej robienie preparatu mija się z celem). Do tego celu dobry jest lakier poliuretanowy, kleje ( żywice) epoksydowe o długim ( 24 h) czasie polimeryzacji (te o krótkim czasie strasznie się mażą i są dalekie do tego, co zwie się estetyką) lub zwykły butapren.
--------------------------------------------------------------------------------------
Ja nigdy nie preparowałem kopulatorów, raczej wykonywałem maceracje okazów ( Ixodidae, Argasidae, Anoplura, Sarcoptes i in>) w KOH ewentualnie w kwasie mlekowym na ciepło bądź zimno, w zależności od wielkości okazu, potem płukanie tudzież usunięcie zmacerowanych wnętrzności ( głównie Ixodidae, Pulicidae) pod lupa potem płukanie i odwadnianie i zatapianie. tutaj oczywiście problemy z balsamem kanadyjskim, ale bardzo dobrze sprawdzał się płyn Hoyera, żelato glicerol. te media żeby nie wysychały obwodzę bezbarwnym lakierem do paznokci. Natomiast nowym z mediów jest zaadoptowany Histofluid. co prawda przeznaczeniem jego jest zatapianie preparatów histologicznych, ale się nadaje, szybko schnie łatwo się nawarstwia na preparat. sporządzenie dobrego preparatu to sztuka, i to prawdziwa
-------------------------------------------------------------------------------------
Swoją drogą, opisywanie preparatyki kopulatorów to trudna sprawa, jest w tym masę sztuczek technicznych związanych np. z przenoszeniem delikatnych obiektów o rozmiarach czasem dziesiątych części milimetra; samo wyjęcie czegoś takiego z probówki bez pokazania tychże sztuczek może początkującemu wydać się nie do zrobienia... Ja czasem preparuję np. elementy aparatu gębowego z okazu o długości pół milimetra, nie zgubić tego w czasie odwadniania to jest dopiero wyzwanie... Najlepiej takie rzeczy jednak pokazać.
Krótki opis preparacji kopulatorów motyli znajdziesz tutaj:
http://www.lepidoptera.slask.pl/badania.html
-------------------------------------------------------------------------------------
BADANIE NARZĄDÓW ROZRODCZYCH MOTYLI
Aby zbadać aparat kopulacyjny motyla potrzebny nam jest mikroskop stereoskopowy (binokular) o powiększeniu najmniej 50x, probówki, igły preparacyjne, szkiełka podstawowe i nakrywkowe oraz pewne odczynniki chemiczne. Najpierw odcinam cały odwłok motyla (dlatego, że u niektórych gatunków aparat genitalny zajmuje całą długość odwłoka). Jeśli jest to suchy okaz, to igłą preparacyjną odłamuję odwłok przytrzymując tułów motyla, aby się nie odłamał razem z odwłokiem. Następnie umieszczam odwłok w dość szerokiej probówce i wlewam niewielką ilość 10% roztworu ługu sodowego (NaOH) lub potasowego (KOH). Potem ogrzewam probówkę nad palnikiem gazowym przez kilka minut, uważając aby zawartość się za bardzo nie gotowała, bo może się wylać. Nigdy nie trzymaj ogrzewanej probówki na ogniu w swoim kierunku, bo to grozi poparzeniem! Zalewam probówkę wodą i kładę na jasnym talerzu, aby odwłok wylał się wraz z wodą na talerz, co skutecznie zapobiega wylaniu się go do zlewu. Potem trzeba odwłok umieścić w kropli wody na szkiełku podstawowym pod mikroskopem. Następnie, używając igieł preparacyjnych oddzielam aparat kopulacyjny od odwłoka. U samca jest to dość łatwe, u samicy często trzeba przeciąć odwłok między VII a VIII segmentem, by wynicować aparat kopulacyjny z odwłoka. Jeśli są problemy z oddzieleniem tkanek miękkich od aparatu kopulacyjnego, to trzeba macerowanie odwłoka powtórzyć, jednak z wyczuciem - gdyż, jeśli przesadzisz z podgrzewaniem, to możesz cały narząd rozrodczy rozgotować. Teraz już można aparat badać, opisywać, rysować. Trzeba jednak pamiętać, żeby obiekt badawczy był zawsze w kropli wody, bo inaczej wyschnie i nie będzie się do niczego nadawał.
Następnie należy z aparatu kopulacyjnego wykonać trwały preparat mikroskopowy. Najpierw układam aparat w odpowiedniej pozycji, zależnie od tego, jakie cechy są ważne dla identyfikacji gatunku. Często się zdarza, że jest problem z otwarciem, rozłożeniem walw u samca. Ja mam na to taki sposób, że umieszczam aparat w kropelce miodu, wtedy o wiele łatwiej jest rozewrzeć walwy w żądany sposób. Potem obiekt trzeba odwodnić czystym spirytusem (żadnym salicylowym itp., bo one posiadają zanieczyszczenia). Dalej usuwam ligniną spirytus i zalewam preparat ksylenem. Po usunięciu ksylenu dodaję na szkiełko kroplę balsamu kanadyjskiego (żywicy z jodły kanadyjskiej) i kładę na nią kawałek szkiełka nakrywkowego. Zamiast balsamu kanadyjskiego można też stosować Euparal, który jest żywicą syntetyczną. Taki preparat zostawiamy na kilka dni, aby wysechł, potem można go przechowywać przez dziesiątki lat bez jakichś większych zmian.
Pozostaje nam jeszcze jedna bardzo ważna sprawa. Każdy preparat musi mieć etykietę. Ja stosuję papier samoprzylepny, wielkości cenówek. Przyklejam dwie etykietki, po obu stronach preparatu. Na jednej umieszczam nazwę rodziny, gatunku oraz miejsce i datę złowienia. Na drugiej wpisuję numer preparatu (taki sam umieszczam pod okazem motyla), nazwisko preparatora oraz zastosowany środek zamykający. Zbiór preparatów należy przechowywać w odpowiednich pudełkach.))
-------------------------------------------------------------------------------------
O preparowaniu kopulatorów czy spermatek z małych okazów
Paweł Jałoszyński
Narzędzia:
1) minucje osadzone w zapałkach - dwie sztuki, akurat jedną mam prostą a druga się nieco na końcu zagięła, co bardzo pomaga, ale w tej chwili jest mi w zasadzie obojętne, dwie proste też mogą być;
2) naczynia do rozpuszczalników - jak już pisałem, u mnie to są kapsle od polietylenowych PCR-ówek, średnica ok. 5-6 mm, akurat mam cztery sztuki przyklejone "w kwadrat" balsamem kanadyjskim do szkiełka podstawowego, a teraz właśnie zrobiłem sobie taki zestaw na dużej szalce Petriego, co ma tę zaletę, że trudniej się gubi w bałaganie i cokolwiek by się na szkle nie położyło nie spadnie poza krawędź. W zasadzie używam dwóch z tych naczyń - do jednego kropla izopropanolu, do drugiego ksylenu; dwa pozostałe są rezerwowe. Co jakiś czas trzeba wywalić i zrobić nowe - nie opłaca się tego czyścić.
3) standardowe wyposażenie i materiały, czyli binokular, pipeta, duże szpilki, balsam itd.
Niezależnie od tego czy okaz jest dopiero co zabity czy też rozwilżony zawsze preparuję w kropli wody pod binokularem. Ten etap to jest kwestia zręczności i precyzji rąk, więc każdy musi sobie sam poćwiczyć. Czasami łatwiej wyciąga się co trzeba jak okaz jest nogami do góry, czasami normalne. Sam okaz przytrzymuję jedną minucją a w odwłoku dłubię drugą; czasem da się łatwo wyciągnąć kopulator, a czasem trzeba oderwać odwłok. W przypadku spermatek odwłok zawsze trzeba urwać, a czasami niestety spermateka kryje się głęboko w tułowiu (jak u niektórych Scydmaenidae) i łatwo ją zgubić (to są obiekty o średnicy rzędu dziesiątych części milimetra), trzeba się nieźle naszukać gdzie to cholerstwo jest. Jak już to, co trzeba jest wyciągnięte i jako tako oczyszczone z ewentualnych przylepionych śmieci to obydwoma minucjami wyciągam to z wody (to jest niezła akrobacja, nie zawsze da się za pierwszym razem) - dokładniej obiekt (fiut czy spermateka) jest w kropli wody uwięzionej pomiędzy końcami szpilek (czasem da się i jedną szpilką, to już jak samo wyjdzie). Przenoszę obiekt do izopropanolu (szkło z "naczyniami" jest obok binokularu); tutaj trzeba bardzo uważać czy na pewno to, co się przenosi spadło ze szpilki w rozpuszczalniku. Wracam do chrząszcza pływającego w kropli wody pod binokularem - wyciągam go (też minucjami) na leżącą obok binokularu bibułę, razem z np. oderwanym odwłokiem. Ścieram kroplę wody ze stolika binokularu i osuszonego chrząszcza przekładam (znowu minucje, ale jak ktoś ma delikatne ręce to może być pęseta) pod binokular i naklejam na kartonik (metodą może mało tradycyjną, ale skuteczną - okaz na kroplę kleju na kartoniku kładę za pomocą dużej, dopiero co ...polizanej szpilki. To oczywiście kwestia wprawy i przyzwyczajeń, trzeba uważać, żeby nie ufajdać okazu, alternatywą jest oczywiście pęseta albo wilgotny pędzelek, co kto lubi. OK, okaz przyklejony, kartonik naszpilony i odłożony na bok, powrót do odwadniającego się w tym czasie fiuta. Przenoszę moją szalkę Petriego na stolik binokularu i sprawdzam czy przypadkiem fiut nie jest zapowietrzony (rzadko przy świeżych okazach, prawie zawsze przy rozwilżanych). Jeśli jest, to przekładam go minucjami do PCR-ówki z ksylenem do następnego dnia, zwykle to wystarcza do całkowitego odpowietrzenia.
Technika wyciągania fiuta z tej probówki też może być warta paru słów - odwracam probówkę dnem do góry tak, żeby obiekt spłynął na kapsel, po czym znowu odwracam probówkę - obiekt powinien zostać pod kapslem (nie zawsze tak jest, ale przy odrobinie wprawy wystarczająco często). Bardzo ostrożnie otwieram probówkę (trzeba uniknąć odskoczenia kapsla, bo fiut się katapultuje i już go nigdy nie znajdziemy...). Kapsel PCR-ówki jest z boku połączony z samą probówką, więc można go odemknąć o 90 stopni w stosunku do długiej osi probówki - wtedy kładę probówkę pod binokular kapslem na stolik i patrzę czy obiekt jest na kapslu czy nie. Jak nie to zamykam i operację z obracaniem powtarzam do skutku. Bardzo rzadko nie daję rady umieścić obiektu na kapslu i wtedy pozostaje dość karkołomna operacja - obiekt jest w ksylenie na dnie probówki, widać to patrząc w otwartą probówkę pod binokularem, i po odwróceniu uparcie przy tym dnie pozostaje, więc w odwróconej pozycji (fiut cały czas przy dnie) otwieram probówkę nad bibułą, żeby pozbyć się ksylenu, odwracam, odcinam nożyczkami samo dno na jakieś 5 mm i z tego już łatwo minucjami wyciągam obiekt. Brzmi może na skomplikowaną operację, ale w rzeczywistości jest bardzo proste, i w dodatku taka konieczność zdarza mi się bardzo rzadko, zwykle jednak fiut zostaje pod kapslem przy odwracaniu probówki. No dobrze, wracamy do sytuacji takiej, że po obejrzeniu obiektu w izopropanolu pod binokularem okazał się on całkowicie odpowietrzony. Wtedy minucjami przenoszę go do sąsiadującego naczynia z ksylenem i zostawiam tam na pół minuty czy minutę, w każdym razie takie czasy wchodzą w grę. Oczywiście im większy obiekt tym dłużej trzeba go odwadniać w izopropanolu, a potem najlepiej przenieść do kolejnej porcji tego samego środka, żeby pozbyć się śladów wody, i dopiero potem do ksylenu. Przy fiutach mających o. 0,5 mm nie ma takiej potrzeby, jedno moczenie w izopropanolu i jedno w ksylenie wystarcza. W czasie, jak fiut jest w ksylenie, wycinam sobie prostokąt z plastiku i kładę go na szalce blisko naczynia z ksylenem. Za pomocą zwykłej (tj. dużej) szpilki nakładam na plastik kroplę balsamu (trzeba pamiętać o wycieraniu szpilki, żeby jej potem do czegoś nie przykleić). W balsamie maczam koniuszek minucji i szybko (i b. delikatnie) dotykam obiektu w ksylenie tak, żeby się przylepił. To trzeba robić bardzo sprawnie, bo kropla balsamu w ksylenie szybko się rozpuści. To znowu kwestia wprawy, zwykle wychodzi za pierwszym razem - obiekt przylepiony do balsamu na szpilce przenosimy z ksylenu do medium na plastiku. Wsadzanie obiektu do kropli balsamu kontroluję pod binokularem (plastik i naczynia są na szalce Petriego, wystarczy ją przesuwać, żeby widzieć pod binokularem, co się robi). Ważne, żeby obiekt był całkowicie zatopiony, bez zbędnych pęcherzyków powietrza. Jeśli trzeba, to na preparat daję kropelkę ksylenu (łebkiem dużej szpilki), co pomaga zatopić obiekt. Plastik podpinam na szpilkę pod okazem; na drugi dzień poprawiam pozycję obiektu w balsamie kładąc znowu kropelkę ksylenu i pozycjonując obiekt minucją.
I na koniec użyteczna technika poszukiwań małych obiektów na podłodze - czasem nam coś spadnie, nie musi to być odstrzelony ze sprężynującej szpilki kopulator, może być cały okaz, jakiś brązowy mikrus pod stołem, tragedia... Jak to odnaleźć? Bierze się arkusz wilgotnej ligniny i kładzie na podłodze... Wszystkie paprochy się przyklejają i teraz wystarczy przejrzeć ligninę pod binokularem.... Czego nikomu nie życzę...
Wiem, że chaotycznie, ale zawsze można dopytać o niejasne szczegóły.
Oznaczanie na podstawie cech budowy kopulatorów jest obecnie stałą praktyką w entomologii. Wymaga ono zazwyczaj przygotowania preparatów mikroskopowych, a to jest dość praco- i czasochłonne. W celu rutynowych oznaczeń, jako medium prześwietlające i odwadniające wykorzystać można dioksan (uwaga — trujący!), a jako medium zamykające balsam kanadyjski lub inną (syntetyczną) żywicę, np. CeDeX (metodę przygotowania preparatów z wykorzystaniem dioksanu podał w jednym z zeszytów kluczy do kusaków Prof. A. Szujecki). Prof. R. Szadziewski (muchówkarz) swego czasu zdradził mi metodę przygotowania preparatów, którą On stosuje: prześwietlenie w fenolu (bardzo trujący!!!), wypłukanie, ewentualne odwodnienie w alkoholu (etanol, izopropanol) i zamknięcie w medium (jeżeli preparat nie był odwadniany, to na przykład w Euparalu, poliwinyllaktofenolu lub glicerożelatynie; jeżeli go odwodniliśmy — w żywicy typu balsam kanadyjski).
Stosowanie dioksanu lub fenolu pozwala uniknąć potrzeby macerowania tkanek miękkich za pomocą roztworów NaOH lub KOH; w przypadku kopulatorów jest to bardzo korzystne!
Niekiedy preparaty mikroskopowe są tak prześwietlone, że często trudno jest dostrzec cechy istotne. W takich przypadkach preparaty należy podbarwić. Technikę barwienia preparatów opisał w kluczu do biedronek R. Bielawski.
Oczywistym jest, że w przypadku okazów o dużej wartości, które włączamy do zbiorów preparaty narządów genitalnych powinny być trwałe i podpięte pod okaz, z którego je wypreparowano. Zamiast podkładek plastikowych stosuję skrawki szkiełek nakrywkowych o wymiarach od 6 x 6 mm, które naklejam na prostokątne kartoniki z dziurką (średnica około 4 mm) przy końcu. Preparat przykrywam drugim skrawkiem szkiełka nakrywkowego.
Jak ciąć szkiełka nakrywkowe? Bardzo prosto. Za pomocą oprawionego w oprawce igły preparacyjnej ziarna korundu (te bierzemy z gruboziarnistego papiery ściernego) lub pióra diamentowego (niestety, bardzo drogie…) delikatnie zarysowujemy szkiełko nakrywkowe, a następnie łamiemy je. Po zniszczeniu kilku szkiełek następne będziemy kroić jak masło!
Polecam zawsze przykrywać preparaty mikroskopowe szkiełkami nakrywkowymi. W ten sposób unikniemy zniekształceń obrazu powstających na skutek oddziaływania krzywizn medium zamykającego.
Inną, niezmiernie interesującą i dającą wspaniałe wyniki sprawą jest wynicowywanie endophallusa. Ale to już inna historia…
Jeszcze trochę o przygotowywaniu preparatów mikroskopowych. Jak zmieniać płyny podczas preparowania? Zależy to w dużej mierze od wielkości preparowanego narządu. Jeżeli jest on dość duży, stosować można małą pipetkę lub nawet zakraplacz. Zmiana płynów w przypadku małych obiektów jest bardzo prosta. Preparat taki najlepiej przygotowywać na szkiełku przedmiotowym z łezką, a płyny zmieniamy w ten sposób, że odciągamy je skrawkiem bibuły. Z zakraplaniem nie powinno być chyba kłopotu
-------------------------------------------------------------------------------------
Trochę mi się włos zjeżył... Byłbym bardzo daleki od zachęcania kogokolwiek do pracy z fenolem czy dioksanem w warunkach domowych. Oparzenia fenolem potrafią się goić latami (wiem co mówię, pracuję z fenolem na codzień, a i oparzyć się zdarzyło), opary działają drażniąco na błony śluzowe, nie daj Boże robić coś z fenolem w domu, w którym są dzieci.... Dioksan jest łatwopalny, zaleca się przechowywać go pod azotem, bo jeśli jest bezwodny to powoli reaguje z tlenem z powietrza tworząc nadtlenki, które mają przykrą właściwość wybuchania w nieodpowiednich momentach... To jest bardzo nieprzyjemna trucizna, powoduje uszkodzenie wątroby i nerek i zaburzenia funkcjonowania układu nerwowego, jest też mutagenem i kancerogenem. Zdecydowanie odradzam eksperymentowanie z tymi związkami w domu; chyba, że ktoś ma dobre przygotowanie chemiczne i dokładnie wie co robi (albo i tak ma raka i już mu wszystko jedno...). Osobiście nie odważyłbym się używać dioksanu w innych warunkach niż pod dobrze działającym wyciągiem; z fenolem mam dużą (wieloletnią) praktykę i też w domu bym go nawet nie trzymał...
Euparal tylko za granicą. Za duże dość pieniądze - około 200 zł. za butelkę 100 g. i niewiele mniej za taką samą porcję esencji euparalu. Balsam kanadyjski pewnie można dostać w Polsce, ale nie mam na ten temat żadnych informacji. Poczekajmy na posty innych.
W praktyce preparowania kopulatorów Euparal jest powszechnie uważany za lepszy
Odmaczanie
Ja stosuje dwie metody w zależności od wielkości chrząszcza i jego delikatności. Gdy są to okazy małe (tak poniżej 1 cm, ale to też zależy od stopnia sklerotyzacji) i delikatne to wrzucam je do octu (takiego zwykłego ze sklepu - 10%) i podgotowuje to pierwszego lekkiego wrzenia, ale trzeba bardzo uważać by nie przegapić momentu, kiedy należy przestać gotować chrząszczyka gdyż inaczej ciśnienie wysadza skrzydła spod pokryw i trudno je potem z powrotem włożyć, więc obserwuje gotującego się chrząszcza i gdy pojawią się pierwsze bąbelki powietrza i zaczyna ocet parować szybko go wyciągam, to rozmiękczanie trzeba trochę wyćwiczyć sobie, właśnie ze względu na omówiony powyżej moment. Duże chrząszcze natomiast i mocno zesklerotyzowane po prostu wrzucam na parę chwil do wrzątku.
-------------------------------------------------------------------------------------
Z tym octem to ciekawa sprawa. Ja go stosuję do wstępnego nawilżenia owada przed wrzuceniem do benzyny na dłuższy okres czasu (taka nowa metoda przechowywania . Chodzi o to, że benzyna (ekstrakcyjna) "wysusza" nieco owada, czyli przed włożeniem należy wyposażyć go w wodę. Oczywiście można to zrobić i po wyjęciu, ale lepiej wyjmować z benzyny elastyczne okazy. A więc reasumując: ocet dobrze nawilża, utrzymuje wodę w ciele owada i przy okazji zapobiega procesom gnilnym. Ale tej metody z nawilżaniem nie znałem. Dzięki. Jacek Kurzawa
-------------------------------------------------------------------------------------
Moje doświadczenia na ten temat są następujące:
- powolne rozwilżanie w temperaturze pokojowej jest możliwe, ale należy do wody w pojemniku dodać trochę octu - niskie pH zapobiega wzrostowi większości mikroorganizmów przez dość długi czas
- przedłużyć można rozwilżanie, jeśli pojemnik trzyma się np. w lodówce (w niskiej temperaturze mikroby też wolniej rosną)
- do wody gdzieś na minimum noc wkładam także świeżo zatrute chrząszcze - znakomicie miękną stawy, odnóża i czułki lepiej się układają; także woda odmywa nieco wydzielin, którymi niekiedy owad pokrywa się podczas zatruwania
- teraz często nawet nie wkładam owada bezpośrednio do cieczy, ale nawilżam leżącego na kawałku kartonu wpiętego w pojemniku ponad lustro płynu; wysoka wilgotność w pojemniku często jest wystarczająca, aby owad już po jednej, dwóch dobach nadawał się do rozpinania.
Oczywiście, pojemnik zawsze jest zamknięty od góry.
Trudne jest niekiedy odwilżenie okazów, które były uprzednio odtłuszczone kąpielą w np. ksylenie, czy octanie etylu. Wówczas podczas odwilżania z ciała owada niekiedy wypływają jakieś "zawartości", które osadzają się np. na włoskach tułowia, czy odwłoka.
Z innych owadów:
próbowałem rozwilżać wysuszone cykady, ale ich błoniaste skrzydła nie były gładkie (jakby napięte), lecz wyraźnie się marszczyły - efekt ten nie znikał po ponownym wysuszeniu.
A tak poważnie, to ja na zimno już od lat niczego nie rozwilżam, drobnym okazom (większość materiału, którym się zajmuje) wystarczają 2 min. w gorącej wodzie destylowanej (gorąca, to jest taka, kiedy mogę w nią palec wsadzić bez obawy o pobicie rekordu w skoku wzwyż, maks. jakieś 50-60 stopni). Najlepiej raczej większą objętość, czyli np. szklanka, żeby rozpuszczający się klej z kartonika się rozcieńczył i nie ufajdał włosków okazu (nawet płukać nie trzeba). Jak się używa wody z kranu, to dość często takie maluchy po wyschnięciu maja nalot z tego całego syfu, który się z wody wytrąca (czyli głównie kwaśne węglany wapnia i magnezu). Duże, ciemne zwierzaki z gruba chityna spokojnie można wrzucić do wrzątku, jak napisał Marek. Raz, ze szybko, dwa, ze wystarcza to za dezynfekcje. Odrobina octu dolana do takiej kąpieli znakomicie poprawia elastyczność okazu. Normalnie kwas octowy ma działanie obkurczające tkanki, wiec dodaje się go do różnych utrwalaczy alkoholowych, żeby równoważył spęczniające właściwości etanolu, co pozwala zachować okazy bez niepotrzebnych deformacji. Przy rozwilżaniu suchego materiału ocet przyspiesza penetracje roztworu do tkanek, poprawia tez (choć czasem trudno to zauważyć) zblaknięte kolory u niektórych chrząszczy.
-------------------------------------------------------------------------------------
Po pierwsze, tymol jest ciałem stałym, wiec sprzedaje się go nie na mililitry, tylko na gramy. Po drugie, jedynym działaniem tymolu jest zabijanie grzybów, i do tego celu wystarczy mikroskopijny, ledwo widoczny gołym okiem kryształek wrzucony do szklanki cieplej wody. Tymol ma bardzo małą rozpuszczalność w wodzie, ale to, co z takiej malej ilości zdoła się rozpuścić w zupełności wystarcza do ochrony przed grzybami. Lepiej jest zresztą spryskać wnętrze szafy na gabloty etanolowym roztworem tymolu (wystarczy stężenie rzędu 0,1-0,5%). Rzecz jest powszechnie znana, ale u nas wilgotność powietrza nie jest aż tak duża, żeby pleśń była wielkim problemem, wiec w zasadzie nikt tego nie stosuje (może częściej w zielnikach). Typowo kryształek tymolu wkłada się do probówek z suchym materiałem, który ma długo leżeć, albo do kopert; na pewno nie zapleśnieje. Trzeba pamiętać, ze Tymol sublimuje i po jakimś czasie cały wyparuje; wiec daje się go tyle, żeby łatwo wyczuć jego zapach (a właściwie czas, kiedy już tego zapachu nie ma).
To, co piszesz o "poprawianiu parowania wody" to bzdury.
Zupełnie nie rozumiem tych udziwnionych patentów - całe życie rozwilżam okazy w wodzie o temp. ok. 60 st. C z odrobiną octu i jeszcze mi się nie zdarzyło, żeby trwało to dłużej niż 20 minut, niezależnie od wielkości.
Na szalce Petriego kładę ligninę lub biały papier toaletowy (ważne by zawierał jak najmniej dodatków poza ligniną, najlepiej same włókna bez wybielaczy i innych udziwnień). Na tym układam okazy do odwilżenia i wkraplam wodę (koniecznie destylowaną, szczególnie, gdy okazy mają kilka mm). Dodatkowo kropla czy dwie octu nie zawadzi. Malutkie chrząszczyki są gotowe do preparowania po kilkunastu minutach, większe po kilku godzinach.
Uwaga: zauważyłem, że jakkolwiek wyższa temperatura trochę przyśpiesza rozmiękanie okazu to ustawienie w/w szalki z okazami pod np. żarówką może dać efekt przeciwny. Co prawda szalka zdrowo zaparuje, ale okazy (szczególnie małe) wewnątrz wyschną! Podobnie traktowanie okazu gorącą parą wodną często zmienia jego barwę (przyciemnia okaz).
Osobny temat to okazy sprężyste. Ze względu na chroniczny brak czasu nie mocuję się z nimi, lecz naklejam na trójkąt. Przy większych okazach można się pokusić o "gimnastykę" okazu.
Ciekawi mnie natomiast temat przyczyn sprężystości okazu. Często jest to cała próbka z danego stanowiska. Zauważyłem, że najczęściej sprężyste są okazy, które zbyt długo (w stresie) przebywały niestrute (niedotrute) w zatruwaczce, często ze swoimi naturalnymi drapieżcami. I częściej sprężyste są samce (bardziej wrażliwe na stres??).
To tyle moich spostrzeżeń. Co na temat sprężystości okazów sądzą inni??
-------------------------------------------------------------------------------------
Cóż amoniak przechowuje w naczyniu ze szlifem, kto miał laborki z chemii wie, co to jest, a w czasie odmaczania owadów nie wkładam do tego amoniaku paluchów. co to zmiany barw, nie zauważylem większych zmian, choć nie wykluczone, że niektóre gatunki mogą mieć do tego tendencje. Co do trwałości to na bieżąco nie widzę nic szczególnego, jak owady rozmaczane będą się zachowywać za 10-15 lat zobaczymy.