Preparaty mikroskopowe - białe smugi

Metody preparowania, usypiania, problemy, sposoby.
beksinski
Posty: 214
Rejestracja: sobota, 25 lutego 2006, 23:01
Lokalizacja: Warszawa
Kontakt:

Preparaty mikroskopowe - białe smugi

Post autor: beksinski »

Witam,

nie mam zbyt duzego doświadczenia w robieniu preparatów. Na obecnym etapie mam pewien problem z białymi smugami wokół aparatu. Czy jest to związane z niedostatecznie długą maceracją odwłoka i pozostałościami tkanek miękkich? Zauważyłem również, że białe smugi po pewnym czasie powoli zanikają.

Drugim moim problemem jest zbyt duża ilość bąbelków powietrza. Podczas pozycjonowania aparatu na szkiełku nigdy nie udaje mi się nie wprowadzić dodatkowych. Czy może to być wynikiem zbyt dużej gęstości medium, w którym umieszczam aparat?

Wiem, że sporo zostało juz napisane, zwłaszcza na drugi temat, ale od teorii do praktyki jest jest jeszcze mase czasu i wylanych łez :)

Będę wdzięczny za pomoc.

Jacek
Pawel Jaloszynski
Posty: 1887
Rejestracja: czwartek, 5 lutego 2004, 02:00
Lokalizacja: Palearktyka

Re: Preparaty mikroskopowe - białe smugi

Post autor: Pawel Jaloszynski »

beksinski pisze: Czy jest to związane z niedostatecznie długą maceracją odwłoka
Co macerujesz (caly odwlok, sam edeagus; jakie duze) w czym, w jakiej temperaturze, jak dlugo?
beksinski pisze:i pozostałościami tkanek miękkich?
Na to pytanie mozna odpowiedziec wylacznie patrzac na preparat pod mikroskopem, wiec tylko ty mozesz to stwierdzic.
beksinski pisze: Zauważyłem również, że białe smugi po pewnym czasie powoli zanikają.
W czym zatapiasz?
beksinski pisze:Drugim moim problemem jest zbyt duża ilość bąbelków powietrza. Podczas pozycjonowania aparatu na szkiełku nigdy nie udaje mi się nie wprowadzić dodatkowych. Czy może to być wynikiem zbyt dużej gęstości medium, w którym umieszczam aparat?.
W czym zatapiasz?

Troche za malo danych podales, zeby w jakikolwiek sposob ci pomoc...

Pawel
Awatar użytkownika
Jacek Kalisiak
Posty: 3268
Rejestracja: wtorek, 24 sierpnia 2004, 14:50
Lokalizacja: Łódź
Podziękował(-a): 4 times

Post autor: Jacek Kalisiak »

Jacek nic nie piszesz o tym, co z tymi aparatami robisz, ani w czym je docelowo umieszczasz.
Ja kiedyś, kiedy umieszczałem aparat w balsamie robiłem to w następującej kolejności:
- KOH 10% - pozbywanie się części miękkich
- alkohol
- ksylen
- balsam
Dokładniej pisał o tym Paweł Jałoszyński
viewtopic.php?t=2427

Teraz większość preparatów trzymam w glicerynie i ograniczam się do KOH i wypłukania po nim, a ewentualne powietrze mi nie przeszkadza na ten moment. Mam na myśli materiały robocze oczywiście.

Paweł już się zgłosił :mrgreen:
Przemek Zięba

Post autor: Przemek Zięba »

preparaty kiepsko odwodnione, szkoda się powtarzać ale tez bym zapytał w czym zatapiasz..
beksinski
Posty: 214
Rejestracja: sobota, 25 lutego 2006, 23:01
Lokalizacja: Warszawa
Kontakt:

Post autor: beksinski »

Przede wszystkim dzięki Pawle i Jacku za szybki odzew.

Już odpowiadam, maceruje odwłoki motyla w KOH 10% w temperaturze pokojowej przez około 30h (wszystko zależy od wielkości odwłoka). Są to zarówno mikry jak i większe motyle. Opisując problem, miałem akurat na myśli aparat samca pewnej sówki. Robię preparaty z całego aparatu, nie tylko z edeagusa. Walwy też są kluczowe czasem.

Maceracje zazwyczaj przerywam, gdy segmenty odwłoka robią się na tyle przezroczyste, że widać w jakim stanie są miękkie tkanki wewnatrz i sam aparat. Nigdy jednak nie jestem w stanie dokładnie stwierdzić czy pomiędzy chitynowymi elementami aparatu nadal nie ma miękkich tkanek. W tym celu oddzielam odwłok od aparatu i oczyszczam igłami. Na tym etapie myślę, że popełniam błąd. Wydaje mi się, że należałoby wrócić z aparatem do KOH jeśli do chitynowych części przyczepione są choćby niewielkie fragmenty miękkich tkanek. Robię to dlatego, że boję się przesadzić w drugą stronę.

Potem robię stopniowe odwadnianie aparatu poprzez zanurzanie w alkoholu. Potem w glicerynie albo robię preparat trwały. Uzywam Naphrax jako medium do zatapiania, bo ten mi jest najłatwiej kupić na Wyspach Brytyjskich i przesłać samolotem (małe buteleczki zagęszczonego Naphraxu są towarem bezpiecznym). W domu rozcieńczam go Toluenem wg zaleceń producenta, nikt natomiast nie pisze do jakiej konsystencji nalezy Naphrax rozcieńczać. Nie jest to łatwo opisać, gdyż Naphrax bardzo szybko gęstnieje i co jakiś czas trzeba dolewać Toluenu. W związku z czym nigdy nie wiadomo jaka jest aktualna proporcja. Ja to robie na wyczucie do konsystencji miodu, ale jak wiadomo miód tez moze miec różna konsystencje :)

Uzywam zwykłych szkiełek podstawowych i szklanych przykrywkowych.

Pozdrawiam
Jacek
beksinski
Posty: 214
Rejestracja: sobota, 25 lutego 2006, 23:01
Lokalizacja: Warszawa
Kontakt:

Post autor: beksinski »

Dzieki Przemku, powiedz mi zatem jak dlugo powinienem odwadniac, lub ile powinna trwac ostatnia 'kąpiel' w najczystszym alkoholu?
Przemek Zięba

Post autor: Przemek Zięba »

beksinski pisze:Dzieki Przemku, powiedz mi zatem jak dlugo powinienem odwadniac, lub ile powinna trwac ostatnia 'kąpiel' w najczystszym alkoholu?
Od razu wyjasnię że wykonywałem preparaty totalne pasożytów zewnętrznych i swoje obserwacje odnosze do tychże.
niemniej opisane białe ,,smugi zdarzały się zbyt często przy zbyt szybkim odwadnianiu na skróty.
Tzn. przez przerzucenie tylko przez dwa stężenia etanolu np 70% i absolutny. W każdym trzymałem po 10-15 minut.
Dodatkowo wykorzystywałem medium konsystencją zbliżone do Nephraxu (którego nie znam ale z twoich opisów wynika że wiele od zwykłego balsamu kanadyjskiego się nie różni pod względem konsystencji i samo zagęszczania w krótkim czasie) więc problem też na tym polegał, że smużki poprzeplatane były pęcherzykami powietrza, ale to zamierzchłe czasy.
Problem ustępował po lekkim podgrzaniu.
Natomiast wykorzystywanie mediów gdzie odwadnianie nie było wymagane w takim stopniu - jak chociażby archaiczny ale dobry żelato-glicerol, Medium Hoyera efektów smużenia nie dawało.
Wniosek jest taki że albo należy wyjątkowo długo odwadniać,w etanolu, fundując końcową kąpiel w toluenie (przy balsamie fundowałem kąpiel w ksylenie) albo zmienić medium.

Jeszcze jedno pytanie czy po maceracji płuczesz preparat??? Czy prosto z KOH do etanolu??
beksinski
Posty: 214
Rejestracja: sobota, 25 lutego 2006, 23:01
Lokalizacja: Warszawa
Kontakt:

Post autor: beksinski »

Dzieki wielkie. Tak pominąłem ten etap, ale oczywiście płuczę, na tym etapie pozbywam się niechcianych fragmentów odwłoka, więc jak później przenoszę aparat do roztworu alkoholu 70%, to jest on juz oczyszczony. Potem stopniowo przenoszę do 80% i 99%. Ale może za krótko. Eksperymentowałem tez z podgrzaniem, faktycznie babelki znikają szybciej ale minimalne smugi pozostaja.

Czy moze to byc zwiazane z tym, ze przenosze aparat z alkoholu do Naphraxu? Moze tu lezy blad, moze lepiej jak mowisz przeprowadzic jeszcze zanurzenie w Toluenie?

Dzieki za odpowiedz.
Jacek
Przemek Zięba

Post autor: Przemek Zięba »

Ja bym zanurzył w toluenie przez analogię do ksylenu, dodatkowo wprowadzając do szeregu etanolowego stężenia 35% i 50%, no może z tym 50% przesadziłem ale zaczynałem zawsze od 35%, jak szereg to szereg czyli co najmniej 3 :mrgreen: popróbuj i jeśli możesz napisz coś o tym Naphraxie, to jakiś syntetyk czy żywica??
beksinski
Posty: 214
Rejestracja: sobota, 25 lutego 2006, 23:01
Lokalizacja: Warszawa
Kontakt:

Post autor: beksinski »

O Naphraxie:

Naphrax has become the mountant of choice for diatom study. In solution the refractive index of naphrax is 1.65. As part of the mounting process the naphrax is heated and the solvent toluene is driven off and the refractive index rises to 1.73. Naphrax uses toluene as its solvent.

ze strony: http://www.brunelmicroscopes.co.uk/naphrax.html
Pawel Jaloszynski
Posty: 1887
Rejestracja: czwartek, 5 lutego 2004, 02:00
Lokalizacja: Palearktyka

Post autor: Pawel Jaloszynski »

beksinski pisze: Maceracje zazwyczaj przerywam, gdy segmenty odwłoka robią się na tyle przezroczyste, że widać w jakim stanie są miękkie tkanki wewnatrz i sam aparat. Nigdy jednak nie jestem w stanie dokładnie stwierdzić czy pomiędzy chitynowymi elementami aparatu nadal nie ma miękkich tkanek.
Chyba motylarze bardziej ci pomoga, bo jednak kluczowe jest to, co chcesz zobaczyc, a to nie jest to samo czego szuka sie u chrzaszczy. Ale kilka rzeczy powinno byc identycznych.

Jesli po maceracji widzisz te detale, ktore chcesz widziec, to pozostalosci tkanek miekkich (jesli zostana dobrze odwodnione) nie powinny w niczym przeszkadzac. Do tego stopnia, ze ja 99% preparatow robie bez jakiejkolwiek maceracji. Dobre odwodnienie i przeswietlajace wlasciwosci ksylenu (duzo lepsze od gliceryny) sa wystarczajace, zeby tkanki miekkie staly sie omalze niewidoczne. Maceruje tylko duze rzeczy, gdzie jest np. kawal tkanki miesniowej, ktora cos zaslania. Kluczowe sa trzy rzeczy:

- dokladne plukanie po KOH (najlepiej w bardzo rozcienczonym kwasie octowym + drugi raz w wodzie dest., lub nawet raz w wodzie, drugi w occie, trzeci w wodzie);

- odpowietrzenie (to tylko kwestia czasu, najlepiej calkowicie odpowietrzyc na etapie alkoholu);

- odwodnienie.

To ostatnie jest w zasadzie najwazniejsze, i tu widze zrodlo twoich klopotow. Ja odwadniam wszystko w izopropanolu, stosunkowo krotko (rozmaczane okazy 24h, wyjete z zatruwaczki czasem pare minut, zalezy od tego co konkretnie odwadniam), potem znowu krotko (5-10 min) w ksylenie i od razu przenosze do balsamu kanadyjskiego. Nie mam zaufania do jakichkolwiek innych mediow (przynajmniej jesli chodzi o "wieczne" przechowywanie). Balsam jest dla mnie o tyle przewidywalny, ze wiem w czym go rozcienczam, jaki gesty powinien byc (tzn. kiedy przychodzi czas dodac krople ksylenu), w jaki sposob pozniej postepowac z czesciowo zastygnieta kropla z fiutem w srodku itd. Jesli po przeniesieniu obiektu z izopropanolu do ksylenu widze metnawe smugi rozchodzace sie wokol tego obiektu, to wiem, ze nie jest dobrze odwodniony i wtedy powrot do izopropanolu na dluzej.

Przy kazdym srodku odwadniajacym wazne jest, zeby za kazdym razem brac nowa porcje (najwieksze naczynia do odwadniania jakie uzywam to PCRowki, czyli objetosci rzedu 100-200 mikrolitrow). Po kilku odwodnionych preparatach alkohol (jakikolwiek by nie byl) zawiera juz za duzo wody, zeby dzialac. To samo jesli chodzi o ksylen, jak rozpusci sie w nim za duzo etanolu czy izopropanolu to pozniej preparat ma prawo metniec.
beksinski pisze:Potem robię stopniowe odwadnianie aparatu poprzez zanurzanie w alkoholu. Potem w glicerynie albo robię preparat trwały.
Do gliceryny nie musisz odwadniac, wystarczy przeplukac w kropli gliceryny, zeby sie pozbyc nadmiaru wody. Natomiast musisz przed przeniesieniem do twojego ostatecznego medium przeprowadzic obiekt przez rozpuszczalnik, w ktorym to medium zostalo zrobione, czyli w twoim przypadku przez toluen. Ja bym tutaj robil odwadnianie w czystym etanolu lub izopropanolu, potem do czystego ksylenu, potem do toluenu.
beksinski pisze:nikt natomiast nie pisze do jakiej konsystencji nalezy Naphrax rozcieńczać.
Do takiej, zeby bylo wygodnie zatapiac w nim takie obiekty, jakie ci sa potrzebne, to kwestia wyczucia. Ja z balsamem kanadyjskim robie tak, ze pobieram krople szpilka i dobry jest wtedy, kiedy po wzieciu tej kropli nie ciagnie sie "makaron" za szpilka, a rownoczesnie kropla nie ucieka mi z konca szpilki. Klade taka krople na kawalek plastiku, minucja osadzona w zapalce pobieram malenka krople balsamu (z tej znajdujacej sie juz na plastiku), szybko zanurzam minucje w ksylenie, w ktrorym jest obiekt, przyklejam ten obiekt do balsamu, szybko wyciagam minucje i zanurzam jej koniec (z przyklejonym obiektem) w kropli balsamu na plastiku. Pod bionkularem nakladam na taki surowy preparat krople ksylenu (lebkiem duzej szpilki), dzieki czemu moge teraz czysta minucja obrocic obiekt z grubsza do odpowiedniej pozycji. Jesli sa w balsamie pecherzyki powietrza, to zwykle wszystkie uciekaja w ciagu 24h (jesli nie, to znaczy, ze balsam byl duzo za gesty).

Pawel
beksinski
Posty: 214
Rejestracja: sobota, 25 lutego 2006, 23:01
Lokalizacja: Warszawa
Kontakt:

Post autor: beksinski »

Dzięki Pawle za super wyczerpującą odpowiedź. Myślę, że sporo się dowiedziałem i będe próbował dalej, dam znać za jakiś czas jaki jest efekt. Pozdrawiam
Jacek
ODPOWIEDZ

Wróć do „Preparowanie, chemia.”